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Virus del rizado amarillo del tomate de Nueva Delhi (Tomato leaf curl New Delhi virus, ToLCNDV): Un nuevo virus que afecta gravemente cucurbitáceas en Almería y Murcia

Miguel Juárez (Universidad Miguel Hernández; Orihuela, Alicante), Blanca Gosalvez y Miguel A. Aranda (CEBAS-CSIC, Murcia)

Recientemente hemos identificado y caracterizado parcialmente un nuevo geminivirus que está causando estragos en los cultivos de calabacín en Almería y Murcia. Se trata de una cepa de Tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV), un primo hermano de nuestro bien conocido virus de la cuchara (Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV). A continuación vamos a resumir brevemente algo de lo que vamos aprendiendo sobre esta cepa de ToLCNDV.

 ToLCNDV en calabacín en España

La primera detección de ToLCNDV en España la hemos hecho sobre plantas de calabacín en cultivos de Campo de Cartagena (Murcia) y de Almería. Los síntomas que hemos identificado en calabacín en campo hasta ahora incluyen: En plantas en producción, cuando suponemos que la infección ha sido tardía, las hojas jóvenes se rizan y se acucharan, normalmente hacia el envés aunque a veces también hacia el haz, y pueden mostrar un amarilleo muy intenso que “sube” hasta las hojas más jóvenes (contrastando con otros virus que causan amarilleo pero que “suben” menos), la planta detiene su crecimiento, y sobre los frutos se puede observar una rizadura suave en la piel del fruto joven que puede acusarse en los más desarrollados (Figura 1). Cuando la infección es temprana, el rizado y acucharado de las hojas jóvenes es tan intenso que se parece al que causa una infestación muy grave de pulgones; las plántulas se arrepollan completamente y no crecen. En este último caso, es prácticamente imposible que la planta pueda llegar a dar frutos.

Figura 1. Síntomas en plantas y frutos de calabacín infectados por ToLCNDV.

Figura 1. Síntomas en plantas y frutos de calabacín infectados por ToLCNDV.

Partiendo de plantas de campo con síntomas como los descritos más arriba, preparamos unos extractos de DNA que empleamos para hacer PCRs utilizando cebadores genéricos para amplificar un fragmento del gen de la proteína de la cápsida de geminivirus. Obtuvimos productos de amplificación por PCR en todos los casos, indicando que las muestras estaban infectadas por un geminivirus. Los fragmentos de DNA amplificados fueron secuenciados, y las secuencias que obtuvimos tenían una similitud nucleotídica del 97% con secuencias de un aislado de ToLCNDV de la India que, aparentemente, está causando allí una enfermedad grave en pepino que denominan “yellow leaf crumple” (rizado amarillo de la hoja). La similitud nucleotídica de nuestro aislado de ToLCNDV es menor con otros aislados del virus, todos procedentes y caracterizados en India o en el oriente lejano, pero se sitúa entre el 90% y el 95%. Esta detección ha sido la primera que se ha hecho de ToLCNDV en España.

 ToLCNDV en otras especies vegetales en España

A partir de esta primera detección, hemos recogido, recibido y analizado en nuestros laboratorios numerosas muestras de distintas especies de hortalizas, incluyendo pepino, calabaza, melón, pimiento y tomate, además de calabacín. De momento, ninguna muestra de pimiento o tomate estaba infectada con ToLCNDV. Sin embargo, sí que hemos detectado muestras de pepino, calabaza y melón infectadas por este virus. Los síntomas en estas especies incluyen mosaicos amarillos muy intensos, rizados de las hojas y achaparramiento y pérdida de vigor de las plantas muy acusados (Figura 2).

Figura 2. Síntomas en plantas de pepino y melón infectados por ToLCNDV.

Figura 2. Síntomas en plantas de pepino y melón infectados por ToLCNDV.

¿Qué se sabe de este virus?

ToLCNDV se describió por primera vez en 1995 como una variante del complejo de virus causante del rizado amarillo de la hoja del tomate afectando cultivos de tomate en India. Posteriormente, el comité internacional de taxonomía de virus lo reconoció como especie viral independiente. Se trata de un virus de la familia Geminiviridae  y del género Begomovirus, en principio geográficamente confinado al subcontinente indio, pero que ha ido expandiéndose hacia otras zonas de Asia, incluyendo China y el oriente medio. Hoy sabemos que también ha llegado a España.

ToLCNDV tiene un genoma de DNA circular de cadena sencilla que consta de dos componentes, el DNA A y el DNA B, cada uno de 2,5 a 2,8 kb de tamaño. Los dos componentes genómicos comparten una región conservada denominada región común o región intergénica, y codifican las proteínas virales. Además de estos dos componentes genómicos, se ha demostrado que al menos algunos aislados de ToLCNDV tienen asociados DNAs satélites de cadena sencilla, circulares, de aproximadamente 1,3 kb, denominados DNAβ o betasatélites. Los betasatélites dependen de los DNAs A y B para su replicación y contienen una secuencia conservada, pero por lo demás son distintos de los DNAs A y B y codifican una única proteína. Es destacable que estos betasatélites tienen propiedades importantes relacionadas con la determinación de la gravedad de síntomas y, quizá, de la gama de huéspedes.

Al principio, la gama de huéspedes de ToLCNDV parecía esencialmente limitada a solanáceas, incluyendo tomate, pimiento (chile), patata y berenjena, en donde causaba la enfermedad que nosotros conocemos como “cuchara”. Más adelante se observó que este virus también causaba una enfermedad responsable de graves pérdidas en cultivos de cucurbitáceas. Así, a la gama de huéspedes inicialmente determinada hubo que añadir pepino, melón, calabaza, Luffa, sandía y calabacín. En una publicación reciente, un grupo de investigación indio ha identificado una diferenciación de cepas según el huésped (solanáceas frente a cucurbitáceas) y también parece identificar una asociación prioritaria de tipos de betasatélites con las especies huéspedes.

ToLCNDV se transmite de forma persistente y circulativa por mosca blanca (Bemisia tabaci Genn.). Esto implica que las moscas pueden permanecer virulíferas desde poco tiempo después de adquirir el virus hasta que mueren. Por otra parte, se ha determinado que algunos virus de la misma familia pueden transmitirse de generación en generación de mosca, aunque este aspecto se desconoce para ToLCNDV. No se ha determinado que se transmita por contacto ni por la semilla.

Existen diversas herramientas para el diagnóstico de este virus. Como la proteína de la cápsida de los begomovirus está muy conservada, los antisueros generados contra otros begomovirus suelen reconocer a este. Así, los antisueros comerciales para detectar el virus de la cuchara, para Squash leaf curl virus (SLCV) y para Watermelon chlorotic stunt virus (WmCSV) funcionan bien en nuestra manos para detectar ToLCNDV, aunque no permiten discriminar entre ToLCNDV y otras especies de begomovirus. Una PCR seguida por el corte del fragmento de DNA por un enzima de restricción específico está dando buenos resultados en nuestros laboratorios (Figura 3).  Muy pronto dispondremos de sondas específicas que nos permitan determinar la presencia de este virus mediante hibridación molecular.

Figura 3. Detección por PCR-RFLP de ToLCNDV en diversos huéspedes. Para cada huésped se usaron tres muestras. Los productos de PCR aparecen sin digerir en el gel de la derecha (a la izquierda en cada bloque) y digeridos con el enzima de restricción SphI (a la derecha en cada bloque). Dos bandas en los productos de digestión indican la identificación específica de ToLCNDV. Como puede verse, las muestras de tomate fueron negativas en este ensayo.

Figura 3. Detección por PCR-RFLP de ToLCNDV en diversos huéspedes. Para cada huésped se usaron tres muestras. Los productos de PCR aparecen sin digerir en el gel de la derecha (a la izquierda en cada bloque) y digeridos con el enzima de restricción SphI (a la derecha en cada bloque). Dos bandas en los productos de digestión indican la identificación específica de ToLCNDV. Como puede verse, las muestras de tomate fueron negativas en este ensayo.

Los medios de control de la enfermedad son, desafortunadamente, muy limitados. El control de la mosca blanca, la eliminación de las plantas afectadas, evitar el solapamiento de cultivos susceptibles, y la mejora de los cerramientos de los invernaderos (en su caso), son las únicas medidas de control disponibles. Se han identificado algunas fuentes de resistencia en tomate y en Luffa, aunque no nos consta que se hayan introgresado en variedades comerciales.

 ¿Qué amenazas representa ToLCNDV en el Sureste español?

La introducción de este virus en España ha sido una muy mala noticia. Desde un punto de vista epidemiológico es de esperar que se comporte como se comportó nuestro conocido virus de la cuchara, con la salvedad de que la gama de huéspedes descrita para este virus es más amplia.  El que potencialmente afecte a cultivos muy diversos puede hacer que exista en el campo una fuente continua de inóculo, con lo cual la dispersión de la enfermedad sólo estará limitada por la presencia o no de mosca blanca. Ojalá la cepa introducida en España sea específica de cucurbitáceas y no se expanda a otros cultivos. En cualquier caso es imprescindible adoptar medidas urgentes para controlar la expansión de ToLCNDV, y seguir estudiando la biología de este virus para poder diseñar estrategias de control adecuadas.

 

 

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VI International Symposium on Almonds and Pistachios

Federico Dicenta, Prof. de Investigación del CEBAS-CSIC

Del 27 al 31 de mayo de 2013, en la sede de CajaMurcia en la Gran Vía de Murcia, se celebró el VI International Symposium on Almonds and Pistachios. El evento fue organizado por el Grupo de Mejora Genética de Frutales del Centro de Edafología y Biología Aplicada del Segura del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CEBAS-CSIC) y por la International Society for Horticultural Science (ISHS). Se trata de un simposio internacional que se celebra cada cuatro años y congrega a los mayores expertos del mundo de estos dos cultivos. Las sedes anteriores del simposio fueron Agrigento, Italia (1993), California, EEUU (1997), Zaragoza, España (2001), Teherán, Irán (2005) y Sanliurfa, Turquía (2009).

En el evento participaron más de 100 investigadores de 14 países (Argelia, Australia, Dinamarca, Egipto, España, Estado Unidos, Francia, Irán, Israel, Italia, Marruecos, Serbia, Túnez y Turquía). El simposio constó de siete sesiones temáticas en las que se realizaron exposiciones orales y se presentaron pósteres. Las sesiones fueron moderadas por investigadores de reconocido prestigio internacional en cada uno de los temas.

La conferencia inaugural corrió a cargo del investigador del IRTA D. Francisco Vargas, que habló sobre el gran impacto que la investigación ha tenido en los últimos años sobre la modernización de ambos cultivos en la cuenca mediterránea.

Participantes del simposio.

Participantes del simposio.

La sesión “Mejora Genética” fue moderada por el Dr. Gradziel (Universidad de California, Davis, Estados Unidos) y en ella se puso de manifiesto la importancia que está teniendo el cultivo de las variedades mejoradas sobre la producción y la utilidad de los marcadores moleculares en los programas de mejora.

La sesión “Biología y Fisiología” (moderada por la Dra. Sánchez-Pérez de la Universidad de Copenhague, Dinamarca) abordó la incidencia de la correcta polinización sobre el cuajado de frutos, los problemas derivados de la incompatibilidad floral, y la repercusión de cubrir las necesidades de frio para obtener una floración y producción abundantes. También se presentaron trabajos sobre la multiplicación “in vitro” y sobre las bases moleculares de un carácter de gran importancia en el almendro: el sabor dulce o amargo de la semilla.

El Dr. Mehrnejad (IPRI de Irán) moderó la sesión de “Protección de Cultivos”. En ella se repasaron las plagas y enfermedades de mayor importancia en estos cultivos, así como sobre las diferentes estrategias para controlarlas.

En la sesión de “Tecnología de los Alimentos” (moderada por el Dr.  Romero del IRTA) se analizaron las características químicas y nutritivas de almendras y pistachos en relación con sus usos industriales y se destacaron sus propiedades beneficiosas para la salud. También se presentaron nuevas técnicas moleculares para determinar la trazabilidad de estos frutos secos en los productos elaborados, como el turrón.

Almendras fritas y turrón de la variedad del CEBAS-CSIC, Antoñeta.

Almendras fritas y turrón de la variedad del CEBAS-CSIC, Antoñeta.

El Dr. Ak de la Universidad de Harran, Turquía, moderó la sesión de “Comportamiento Varietal” donde se discutió el comportamiento de variedades y patrones de ambas especies en diferentes condiciones ambientales y de cultivo, destacándose la riqueza de los recursos fitogenéticos disponibles en ambas especies.

La sesión “Técnicas de Cultivo”, fue moderada por Mrs. Louise Ferguson (Universidad de California, Davis, Estados Unidos) y en ella se puso de manifiesto la enorme importancia de un cultivo esmerado sobre la rentabilidad de las explotaciones. Se trataron temas novedosos como la plantación de almendros en alta densidad, diferentes estrategias de riego y su efecto en la producción, la mecanización de la poda o la aplicación de algunos productos químicos para mejorar el cuajado de los frutos.

Finalmente en “Economía y Mercados”, moderada por Mr. Christopher Joyce (Almond Board de Australia), se discutió sobre las tendencias productivas y la demanda creciente de estos productos a nivel mundial, lo que augura la obtención de precios más rentables para los agricultores.

 

Más información: Dr. Federico Dicenta. VI International Symposium on Almonds and Pistachios. CEBAS-CSIC. PO BOX 164. 30100 Espinardo. Murcia (Spain). email: almond.pistachio.2013@cebas.csic.es.

Web: http://www.cebas.csic.es/almond_pistachio_2013/

Breve historia sobre el concepto de “expresión génica” y el papel del RNA en el proceso

Pedro Martínez-Gómez y Manuel Rubio, Departamento de Mejora Genética vegetal, CEBAS-CSIC

Desde que en 1869 el bioquímico alemán Friedrich Miescher descubriera en vendas empapadas en pus los ácidos nucleicos (ADN y ARN) que él llamó en principio nucleína, por hallarse estas sustancias en el núcleo, las historia de estos dos “mellizos” bioquímicos ha sido de éxito y “glamour” para el primero (ADN) y cierto ostracismo y sinsabor para el segundo (ARN).

Amén del concepto de gen esbozado a partir del redescubrimiento de las leyes de Mendel en 1900, los experimentos de Avery, McCarty y MacLeod en bacterias señalaron en 1928 al ADN como responsable de estos genes o de la herencia genética. Además en 1952 las evidencias físicas mediante marcaje radioactivo del ADN de fagos confirmaron esta teoría sobre la asociación de material genético y ADN. Pero fue el descubrimiento de la estructura del ADN en 1953 por Watson y Crick, esa hermosísima estructura de doble hélice, con la definición exacta de gen y el establecimiento (1970) de lo que se denomina el dogma central de la biología molecular: “la información genética puede ser transferida entre los ácidos nucleicos, y a partir de ácidos nucleicos a proteínas, incluyendo la replicación del ADN, transcripción de ARN y la traducción a proteína expresada en el fenotipo”, lo que hizo incrementar esta desigualdad en cuanto a éxito y atractivo en favor del ADN. El ARN era un mero lacayo del ADN.

En este momento nos encontramos en la denominada era “post-genómica”, la cual nos sitúa ante una revolución científica en cuanto a la percepción de la biología molecular. Esta era “post-genómica” se caracteriza, entre otras cosas, por un cambio de perspectiva sobre la expresión de caracteres dónde el centro de gravedad de estos procesos se pone en el estudio del ARN más que en el del ADN. Por eso en este breve artículo queremos insistir en el papel del ARN en los fenómenos de expresión génica, ayudando a que el ARN continúe recortando el terreno perdido frente al ADN, digamos que ahora somos más de ARN que de ADN.

El ARN presenta una estructura más sencilla, en principio con una cadena simple. Sin embargo, su presencia en el núcleo y en el citoplasma de la célula es variable, temporal, y sobre todo casi etérea, de ahí que la fácil degradación del ARN sea el principal hándicap para su estudio. Probablemente su aspecto más “humilde” junto con su carácter más etéreo y degradable han contribuido a ese menor encanto en comparación con el ADN.

El concepto de expresión génica (el paso del ADN a la proteína) ha ido cambiando a lo largo del tiempo. Podemos resumir la historia del papel del ARN en estos fenómenos de expresión génica como un proceso de complicación sistemática (Fig. 1).

expresion génica

Del concepto de ARN como sustancia descrita, como ya hemos comentado, por Miescher en 1869, se pasó en 1960 a un concepto de molécula diversa con al menos dos grandes variantes: un ARN mensajero que era el que producía las proteínas y otros tipos de ARN como el que formaba los ribosomas. Esta aportación de los franceses Jacob y Monod fue crucial para el planteamiento posterior de Crick y se tradujo en la primera descripción de un mecanismo de regulación transcripcional. Por eso, en 1970 se comenzó a hablar del ARN como elemento indispensable en la expresión génica (el mencionado Dogma Fundamental de la Biología Molecular de Francis Crick), aunque fuera como ya comentábamos como acólito (achichincle, como dicen en México) del ADN.

A partir de ahí la complejidad en torno al funcionamiento del ARN no ha hecho nada más que aumentar exponencialmente de la mano de la ciencia norteamericana, que ha desbancado, por desgracia, los inicios europeos en esta materia. En 1978 el bioquímico estadounidense Walter Gilbert describió el gen como una parte de ADN que se expresaba o transcribía a ARN (exón) y otra que no (el intrón). Por tanto el ARN no era un continuo que se transcribía continuamente sino que únicamente una parte de este ADN original llegaba a ARN mensajero. De ahí nace el desafortunadísimo concepto de “ADN basura” como el ADN que no se transcribía.

Para continuar complicando las cosas, en 1993 el grupo de investigadores americanos de Rosalind Lee y Victor Ambros, asombraron al mundo molecular al describir la existencia de una nueva clase de ARNs pequeños (microRNA, smallRNA, etc.) que regulaban el ARNm (de Jacob y Monod) proveniente de los exones (de Gilbert). Pero además, el también norteamericano David Brett en 2001 alertó de que había que tener en cuenta que los exones no se transcribían linealmente a ARNm si no que a veces el corte y empalme de estos (splicing) podía ser alternativo, pudiéndose omitir algunos de los exones, para complicar aún más el proceso.

Finalmente, en 2012 el proyecto ENCODE (The Encyclopedia of DNA Elements), conglomerado de grupos de investigación también liderado por EEUU, ha puesto en su sitio al ARN. Estos nuevos resultados inciden en la importancia de todos los tipos de ARN en la expresión final de todo el ADN (incluyendo el muy mal llamado ADN basura). Además ENCODE en cierto modo inclina por primera vez, aunque ligeramente, la balanza en favor del ARN en cuanto a necesidad de recursos para ir profundizando en estos mecanismos de la vida. Parece que el ARN come parte del terreno perdido frente a su hermano “mellizo” ADN en cuanto a glamour, éxito y presupuesto.

 

EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA EN PLANTAS

Abel Piqueras, Científico Titular del CEBAS-CSIC. Grupo de Biotecnología Vegetal

Se puede definir la totipotencia en los vegetales como la capacidad para regenerar un individuo completo a  partir de una sola célula. El ejemplo de totipotencia más significativo es la embriogénesis somática. Mediante este proceso se pueden obtener embriones no cigóticos  (que no se forman  sexualmente) a partir de cualquier tejido vegetal.

Existen algunos ejemplos en vivo como pueden ser  los embriones nucelares (embriones asexuales que se forman a partir del tejido somático que rodea el saco embrionario) en semillas de cítricos (naranjos y limoneros) o en hojas de Aranto o Espinazo del Diablo (Kalanchoe draigremontiana) (Figura 1 y  2 respectivamente).

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Figura 1. Embriogénesis en limonero.

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Figura 2.- Embriogénesis nucelar en  hojas de Aranto o Espinazo del Diablo (Kalanchoe draigremontiana). (A) Planta de K. daigremontiana; (B) Detalle de una plántula; (F) estadio corazón y cotiledón; (G) (H) Plántula mostrando el hipocotilo; (I) Plántula mostrando raíces adventicias; (J) Abscisión de una hoja. [Imagenes de: Helena M.P. Garcês et al., (2007) Evolution of asexual reproduction in leaves of the genus Kalanchoë. Proc Natl Acad Sci USA 104(39): 15578–15583]

Sin embargo, los casos más frecuentes se pueden obtener a partir del cultivo in vitro de tejidos, siendo el modelo más estudiado la zanahoria.  En este caso, la mayor parte de los estudios realizados sobre embriogénesis somática se han centrado en los diferentes estadios en que se divide.  El primero implica una fase de inducción  en la  que los tejidos somáticos adquieren directa (sin una desdiferenciación previa) o indirectamente (precedidos de una fase de callo) competencia embriogénica. Esta fase se continúa con la expresión del proceso de embriogénesis somática, en el que las células competentes o pro-embriones inician su desarrollo después de recibir un estímulo adecuado. Los estadios coinciden con los de la embriogénesis cigótica (estadios globular, corazón, y torpedo). Finalmente durante la maduración los embriones somáticos se preparan para la germinación mediante desecación y acumulación de reservas.

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Figura 3.- Embriogénesis cigótica y somática en zanahoria (Daucus carota). [Imagen de: V.L. Dodeman et al., (1997) Zygotic embryogenesis versus somatic embryogenesis.  Journal of Experimental Botany 48:1493–1509]

Os dejamos también un video del desarrollo de embriones somáticos en cultivos de tejidos de soja: http://www.youtube.com/watch?v=fL0O5bZabjw

Nuevos retos para la mejora genética de frutales del género Prunus en la era post-genómica

Pedro Martínez-Gómez, Investigador Científico del Departamento de Mejora genética vegetal, CEBAS-CSIC

El descubrimiento de la estructura del ADN (1953), con la definición exacta del gen y el establecimiento (1970) de lo que se denomina el dogma central de la biología molecular: “la información genética puede ser transferida entre los ácidos nucleicos, y a partir de ácidos nucleicos a proteínas, incluyendo la replicación del ADN, transcripción de ARN y la traducción a proteína expresada en el fenotipo” (Figura 1), se erigen como la contribución más importante a las ciencias biológicas en el siglo XX, en lo que ha sido llama la era “genética”.

Este descubrimiento revolucionó los paradigmas científicos de los estudios genéticos en los seres vivos, incluyendo plantas, cambiando la genética de una ciencia fenomenológica y estadística a una ciencia molecular y química. Las cuestiones relacionadas con los mecanismos de transmisión genética, la segregación, la mutación y la expresión de los caracteres fueron reformulados en términos químicos y moleculares. Posteriormente, como resultado del desarrollo de técnicas de secuenciación del ADN se pudo acceder al conocimiento genético a nivel de cada nucleótido en la denominada era de la “genómica”, que ha estado dominando las ciencias biológicas en los últimos 30 años.

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En este momento, en la era “post-genómica”, estamos ante una nueva revolución científica al descubrimiento de la estructura del ADN en los años sesenta y de la secuenciación del ADN en los años ochenta. Esta era “post-genómica” se caracteriza en frutales, al igual que en el caso del resto de organismos vivos, por tres elementos que pueden originar un cambio de paradigma en los planteamientos existentes: a) la incorporación de nuevos métodos de secuenciación masiva tanto de DNA como de RNA, b) el desarrollo de genomas completos, y c) el cambio de perspectiva sobre la expresión de caracteres derivada del proyecto en humanos (ENCODE, The Encyclopedia of DNA Elements) dónde el centro de gravedad de estos procesos se pone en el estudio del RNA más que en el del DNA.

a) Tomó casi 25 años desde el descubrimiento de la estructura del ADN (1953) (Figura 1) hasta el desarrollo de métodos eficaces para la determinación de su secuencia en el genoma (1977). La secuenciación del ADN (el orden de las bases de nucleótidos en una molécula de ADN) ha cambiado nuestra visión de la biología de las plantas y ha desempeñado un papel importante en la investigación biológica moderna. Durante los últimos años, sin embargo, las llamadas metodologías de alto rendimiento (“high-throughput”) para la secuenciación del DNA (DNA-Seq, en 2005) y cDNA proveniente del ARN (RNA-Seq, en 2008) (Figura 1), están causando una revolución en la investigación biológica. Además, la tercera generación de estos ultra secuenciadores pretende ser capaz de determinar la composición de bases de ADN de una sola célula. En estos momentos disponemos de información precisa sobre la constitución de DNA o RNA de una planta sin necesidad de un clonaje previo.

b) La secuenciación del genoma completo del melocotón representa el principal hito de la era de la genómica en especies de Prunus. En 2010 se publicó en la red la primera secuencia completa de un genoma de Prunus, proveniente de un genotipo de melocotonero (www.rosaceae.org), y en estos momentos (en diciembre de 2012) acaba de publicarse la secuencia completa de otra especie, Prunus mume (albaricoquero japonés). Esta información va a permitir localizar en estos genomas de referencia los genes expresados y lo que puede ser más importante los QTLs (Quantitative trait loci) desarrollados mediante la genética clásica de ligamiento que son en estos momentos la fuente más extensa de información sobre la genómica funcional de estas especies arbóreas.

c) Los nuevos hitos antes mencionados han puesto de manifiesto que el dogma central de la biología molecular descrito en 1970 es más complejo de lo inicialmente descrito (Figura 1). El procesamiento del ARN, la conexión entre el ADN y las proteínas, es el auténtico nudo gordiano (una metáfora griega de un problema insoluble resuelto por un golpe de audacia) de esta expresión génica. La traducción del mRNA transcrito maduro (incluyendo eventos de “splicing”) en la proteína (una entrada principal); junto con la presencia de RNA no codificante y no regulatorio como el rRNA y tRNA (otra entrada principal); y la regulación post-transcripcional y post-trasduccional por parte de pequeños ARN no codificantes pero sí reguladores (miRNA, siRNA, Pirna o snoRNA) (varias entradas de menor importancia, pero críticas) producen el resultado final de la expresión del DNA en un fenotipo concreto (Figura 2).

En estos momentos podríamos pues hablar de una nueva “era” en los estudios sobre la genética de los frutales del género Prunus (albaricoquero, almendro, melocotonero, ciruelo, etc.) y su aplicación en el desarrollo de nuevas variedades dentro de los distintos Programas de Mejora Genética. En este nuevo contexto (postgenómico) se presentan una serie de nuevos desafíos biológicos y oportunidades en la aplicación de toda la gama de las ciencias ómicas (genómica, transcriptómica, proteómica, metabolómica e interactómica) en el desarrollo de estrategias eficaces de selección asistida por marcadores en Prunus. Estas oportunidades son de especial interés en el caso de Prunus, donde es limitado el conocimiento de la asociación entre genes y caracteres agronómicos.

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“Mejora asistida mediante marcadores moleculares”

Hola, mi nombre es Juan, soy becario JAE-PREDOC y estoy haciendo mi tesis doctoral en el Departamento de Mejora Vegetal del CEBAS-CSIC. Mis estudios están orientados hacia la mejora de la calidad del fruto en el género Prunus más concretamente en albaricoquero.

Inicialmente antes de mi llegada al Departamento ya había iniciado un programa de mejora que ha dado como fruto la obtención de numerosas variedades de albaricoquero tales como Rojo Pasión, Valorange, Maravilla, Rosa, Mirlo Blanco, Mirlo Naranja o Mirlo Rojo. Como todos sabemos, el albaricoquero es en la mayoría de los casos  una especie autocompatible por lo que su propio polen es válido para autofecundarse y generar frutos. Para la obtención de nuevas variedades no hay más que cruzar diferentes variedades de albaricoquero, evidentemente con unos criterios prestablecidos que dependerán de lo que esperamos conseguir. En el proceso de búsqueda de nuevas variedades debemos de partir de variedades existentes que para cada uno de sus caracteres sean muy distintas entre sí y así poder obtener una progenie que nos de mucha variabilidad, es decir, individuos mas precoces o tardíos en cuanto a floración, frutos con mayor o menor grado de acidez o azúcares, coloración, tamaño, producción, etc.

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Tras llevar a cabo el proceso de los cruzamientos, los frutos obtenidos contienen ya en la semilla esa variabilidad. Estas semillas se siembran en macetas y obteniendo pequeñas plántulas que posteriormente son trasplantadas a campo, las cuales tras 2 o 3 años comenzarán a dar sus primeros frutos. Posteriormente comienza la etapa del fenotipado de la población, que se trata de llevar a cabo un seguimiento de cada individuo en cuanto a fecha de floración (precoz o tardía), maduración, peso de fruto, peso del hueso, color,  acidez, azúcares, firmeza, etc. y todos aquellos parámetros que consideremos oportunos medir.

Una vez realizado el fenotipado de la población durante al menos 2 o 3 años, llevamos a cabo la etapa del genotipado. Esta etapa comienza con la extracción del ADN de muestras de hoja de cada uno de los individuos de nuestra población. Este ADN es posteriormente amplificado mediante la técnica PCR en la que utilizamos marcadores moleculares previamente diseñados específicamente para diferentes especies de Prunus.

Los marcadores moleculares no son más que fragmentos del Genoma del Prunus que en la amplificación del ADN de nuestras muestras van a dar lugar a muchos fragmentos de ADN. Después, mediante electroforesis en geles de agarosa, visualizamos con luz ultravioleta (UV) estos fragmentos de ADN que tienen en conjunto forman un patrón de bandas determinado que se corresponda al de sus parentales, por lo que si hay individuos que amplifican bandas a alturas distintas de ambos parentales esto significa que esos individuos no pertenecen a la población.

La idea general, es que a partir de estos marcadores moleculares, los cuales nos proporcionan pequeños fragmentos del ADN de cada uno de nuestros individuos construimos un mapa genético de la población que incluya los 8 cromosomas del albaricoquero. El mapa genético se realiza mediante programas bioestadísticos.

juan2Ahora bien, una vez obtenidos los datos fenotípicos y genotípicos, éstos se correlacionan estadísticamente mediante otro programa informático para obtener posibles zonas del genoma relacionadas significativamente con alguno de los caracteres mencionados anteriormente (floración, maduración, peso fruto, coloración, acidez, azúcares, firmeza, etc.). Es decir, relacionamos el patrón de bandas obtenido con los datos fenotípicos de cada individuo. Así pues, cuantos más marcadores utilicemos, mayores probabilidades tendremos de encontrar un marcador más cercano a aquellas zonas del Genoma relacionadas con alguno de los parámetros de interés o caracteres medidos.

Así pues, el objetivo final es cercar lo mas posible aquellos genes relacionados con la calidad del fruto para poder diseñar marcadores “chivato” que los identifiquen, de forma que cuando sean utilizados en otras poblaciones desenmascaren si un individuo es mas precoz o tardío, si va a presentar frutos más ácidos o dulces, etc. De esta manera llegaríamos a lo que se conoce como “Mejora asistida mediante marcadores moleculares”. La utilización de ésta técnica nos puede ayudar a adelantar unos años los resultados de los programas de mejora, ya que antes de esperar 3 años para la fase del fenotipado, con la utilización de ciertos marcadores relacionados con calidad de fruto, ya tendríamos la información necesaria de algunas de sus características fenotípicas desde el primer momento, pudiendo eliminar aquellas plantas que no nos resulten interesantes antes su plantación en campo.

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