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Archivo para enero, 2013

Mecanismos antioxidantes de defensa (II): mecanismos enzimáticos.

José A. Hernández Cortés. Investigador Científico del CEBAS-CSIC

En el capítulo anterior describíamos los mecanismos de defensa antioxidantes no enzimáticos, así que toca hablar ahora de los antioxidantes enzimáticos.

ANTIOXIDANTES ENZIMÁTICOS

– El único enzima conocido en la eliminación de radicales O2.- es la superóxido dismutasa (SOD). En realidad existe tres isoenzimas diferentes dependiendo del metal presente en su centro activo (Mn-SOD, Fe-SOD o Cu,Zn-SOD). Este grupo de metaloenzimas cataliza la dismutación del radical superóxido hasta H2O2 y O2:SOD

– El H2O2 puede ser eliminado directamente por la enzima catalasa o bien por la acción de ascorbato peroxidasa (APX), peroxidasas (POX; enzimas muy abundantes en la pared celular y en las vacuolas que eliminan H2O2 utilizando diferentes compuestos fenólicos como poder reductor), glutatión peroxidasa (que elimina H2O2 e hidroperóxidos lipídicos empleando GSH como poder reductor) o peroxiredoxinas usando diferentes moléculas reductoras.

Además, esta batería de enzimas está apoyada por otras enzimas que actúan regenerando moléculas antioxidantes que son empleadas por las enzimas eliminadoras de H2O2. En este grupo, destacan las enzimas deshidroascorbato reductasa y  (DHAR) monodeshidroascorbato reductasa (MDHAR) cuya acción es la de regenerar ascorbato o vitamina C. Glutatión reductasa (GR) regenera glutatión reducido (GSH) que es empleado por la DHAR en el reciclaje del ascorbato. Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) produce NADPH, que es empleado por la actividad GR en el reciclaje del GSH a partir de glutatión oxidado (GSSG).

Las enzimas APX, GR, MDHAR y DHAR actúan de forma coordinada en un ciclo llamada ciclo ascorbato-glutatión (ASC-GSH), cuya función es la de eliminar H2O2 y regenerar los antioxidantes no enzimáticos ascorbato y GSH, los cuales ya describimos en el capítulo anterior.

ASC-GSH

Tanto en nuestro organismo como en las plantas, cuando la generación de ROS supera a los mecanismos de defensa antioxidantes se produce un estrés oxidativo a nivel celular que puede desencadenar una muerte celular. Esto está asociado a la aparición de determinadas patologías en los seres vivos, tales como cáncer, enfermedades cardiovasculares, Alzheimer, Parkinson, esclerosis, entre otras.

Pero, como ya comentamos anteriormente  (https://cienciacebas.wordpress.com/2012/11/05/especies-reactivas-del-oxigeno-amigos-o-enemigos/) las ROS no solo son agentes dañinos para las células, también son usados como mensajeros en cascadas de señalización en una gran variedad de procesos celulares. Por ejemplo, en las plantas las ROS actúan como segundos mensajeros en procesos tan vitales como el desarrollo vegetal y las respuestas de defensa. En animales, las plaquetas, que participan en la reparación de heridas y homeostasis de la sangre, liberan ROS para reclutar más plaquetas en los sitios de lesión. Estas también proporcionan un enlace a la adaptación del sistema inmune a través del reclutamiento de glóbulos blancos. El sistema inmunitario también usa los efectos tóxicos de las ROS haciendo de ellos una parte central de su mecanismo para matar a los agentes patógenos.

Por lo tanto, la función de las ROS en el metabolismo es dual; resultan tóxicos para la célula cuando se acumulan en exceso pero a determinados niveles se ha demostrado que pueden funcionar como moléculas bio-señalizadoras.

oxidative stress

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Mecanismos antioxidantes de defensa (I): mecanismos no enzimáticos

José A. Hernández Cortés. Investigador Científico del CEBAS-CSIC

Como apuntamos en capítulos anteriores, las especies reactivas de oxígeno (ROS) son una consecuencia del metabolismo aerobio. En tejidos vegetales, aproximadamente un 1-2% del oxígeno total consumido conduce a la formación de ROS en condiciones normales. Este porcentaje se incrementa cuando las plantas se someten a condiciones desfavorables como salinidad, sequía, estrés por frío o por altas temperaturas. Hoy día sabemos que los daños producidos en plantas sometidas a condiciones desfavorables, están mediados, en parte, por una incrementada generación de ROS a nivel subcelular. Está demostrado que los ROS se generan en diferentes compartimentos celulares, como mitocondrias, peroxisomas, cloroplastos, citoplasma o en el espacio extracelular, conocido como apoplasto.

De forma resumida podemos decir que el radical superóxido (O2.-) se forma en el cloroplasto, en mitocondrias, en peroxisomas y en la  membrana plasmática.  En estos mismos compartimentos el O2.- es dismutado rápidamente hasta peróxido de hidrogeno (H2O2; agua oxígenada) por acción de unas proteínas llamadas superóxido dismutasas (SODs). El H2O2 además es producido por la acción de peroxidasas en el apoplasto y es formado como producto de reacción por la acción de otras enzimas en distintos compartimentos (glicolato oxidasa y xantina oxidasa en peroxisomas, acil-CoA oxidasa en glioxisomas, amino oxidasa y oxalato oxidasa en apoplasto).

El oxígeno singlete (1O2) se forma por transferencia de energía desde la clorofila excitada hasta el oxígeno en los cloroplastos. Finalmente,  el radical hidroxilo (.OH) se puede formar en cualquier compartimento por la reacción del O2.- y H2O2 en presencia de metales de transición (como el Fe2+ o el Cu+).

esquema ROS modif

Para hacer frente al exceso de producción de ROS las plantas presentan todo un arsenal de mecanismos de defensa que incluye mecanismos enzimáticos y no enzimáticos. Son los conocidos ANTIOXIDANTES.

ANTIOXIDANTES NO ENZIMÁTICOS

Entre los mecanismos no enzimáticos nos encontramos con moléculas como la vitamina C, también denominada ácido ascórbico, el glutatión, compuestos fenólicos, la vitamina A, la vitamina E, el β-caroteno etc… Todas estas moléculas, gracias a sus propiedades antioxidantes tienen también una actividad anticancerígena.

  •  A diferencia de las plantas, nosotros no somos capaces de producir vitamina C, por lo que hemos de incorporarla en la dieta. Alimentos ricos en vitamina C son los cítricos, el pimiento rojo y verde, y las frutas y verduras en general. La vitamina C puede actuar eliminando H2O2 directamente.
  • Alimentos ricos en glutatión (GSH) son los espárragos, espinacas, brócoli, ajo, col, cebollas, berros y coles de Bruselas. A diferencia de la vitamina C, sí podemos producir nuestro propio GSH, siempre y cuando dispongamos de los aminoácidos que lo componen: cisteína, ácido glutámico y glicina. El GSH puede secuestrar H2O2, hidroperóxidos y otros compuestos tóxicos.
  • Los compuestos fenólicos, son unos de los principales metabolitos secundarios de las plantas y su presencia en el reino animal se debe a la ingestión de éstas. Los fenoles se encuentran casi en todos los alimentos de origen vegetal destacando como alimentos ricos en fenoles la cebolla, el , el vino tinto, el cacao o el aceite de oliva virgen. Estos compuestos pueden secuestrar directamente H2O2 y .OH.
  •  Los β-carotenos son considerados como precursores de la vitamina A y puede eliminar directamente el 1O2. Algunos alimentos ricos en betacaroteno son: la zanahoria, los pimientos rojos, el tomate, la calabaza, los boniatos,  el melocotón, los albaricoques, el melón, el mango y la papaya. También son ricos en β-caroteno, vegetales verdes como las espinacas, las acelgas y los berros, y algunos tipos de algas, aunque el color de este pigmento no se aprecia ya que está enmascarado por la clorofila, que les proporciona el color verde.
  •  La vitamina A se encuentra en muchos alimentos, tanto de origen vegetal (zanahoria, espinacas) como de origen animal (hígado, huevos…).
  •  La vitamina E (también conocido como α-tocoferol) se encuentra principalmente en frutos secos y en aceites de semillas como el aceite de oliva y de girasol. Puede detoxificar los peróxidos lipídicos y el 1O2 directamente. Es uno de los principales protectores biológicos de las membranas.

En el próximo capítulo hablaremos de los mecanismos antioxidantes de defensa enzymáticos.

Nuevos retos para la mejora genética de frutales del género Prunus en la era post-genómica

Pedro Martínez-Gómez, Investigador Científico del Departamento de Mejora genética vegetal, CEBAS-CSIC

El descubrimiento de la estructura del ADN (1953), con la definición exacta del gen y el establecimiento (1970) de lo que se denomina el dogma central de la biología molecular: “la información genética puede ser transferida entre los ácidos nucleicos, y a partir de ácidos nucleicos a proteínas, incluyendo la replicación del ADN, transcripción de ARN y la traducción a proteína expresada en el fenotipo” (Figura 1), se erigen como la contribución más importante a las ciencias biológicas en el siglo XX, en lo que ha sido llama la era “genética”.

Este descubrimiento revolucionó los paradigmas científicos de los estudios genéticos en los seres vivos, incluyendo plantas, cambiando la genética de una ciencia fenomenológica y estadística a una ciencia molecular y química. Las cuestiones relacionadas con los mecanismos de transmisión genética, la segregación, la mutación y la expresión de los caracteres fueron reformulados en términos químicos y moleculares. Posteriormente, como resultado del desarrollo de técnicas de secuenciación del ADN se pudo acceder al conocimiento genético a nivel de cada nucleótido en la denominada era de la “genómica”, que ha estado dominando las ciencias biológicas en los últimos 30 años.

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En este momento, en la era “post-genómica”, estamos ante una nueva revolución científica al descubrimiento de la estructura del ADN en los años sesenta y de la secuenciación del ADN en los años ochenta. Esta era “post-genómica” se caracteriza en frutales, al igual que en el caso del resto de organismos vivos, por tres elementos que pueden originar un cambio de paradigma en los planteamientos existentes: a) la incorporación de nuevos métodos de secuenciación masiva tanto de DNA como de RNA, b) el desarrollo de genomas completos, y c) el cambio de perspectiva sobre la expresión de caracteres derivada del proyecto en humanos (ENCODE, The Encyclopedia of DNA Elements) dónde el centro de gravedad de estos procesos se pone en el estudio del RNA más que en el del DNA.

a) Tomó casi 25 años desde el descubrimiento de la estructura del ADN (1953) (Figura 1) hasta el desarrollo de métodos eficaces para la determinación de su secuencia en el genoma (1977). La secuenciación del ADN (el orden de las bases de nucleótidos en una molécula de ADN) ha cambiado nuestra visión de la biología de las plantas y ha desempeñado un papel importante en la investigación biológica moderna. Durante los últimos años, sin embargo, las llamadas metodologías de alto rendimiento (“high-throughput”) para la secuenciación del DNA (DNA-Seq, en 2005) y cDNA proveniente del ARN (RNA-Seq, en 2008) (Figura 1), están causando una revolución en la investigación biológica. Además, la tercera generación de estos ultra secuenciadores pretende ser capaz de determinar la composición de bases de ADN de una sola célula. En estos momentos disponemos de información precisa sobre la constitución de DNA o RNA de una planta sin necesidad de un clonaje previo.

b) La secuenciación del genoma completo del melocotón representa el principal hito de la era de la genómica en especies de Prunus. En 2010 se publicó en la red la primera secuencia completa de un genoma de Prunus, proveniente de un genotipo de melocotonero (www.rosaceae.org), y en estos momentos (en diciembre de 2012) acaba de publicarse la secuencia completa de otra especie, Prunus mume (albaricoquero japonés). Esta información va a permitir localizar en estos genomas de referencia los genes expresados y lo que puede ser más importante los QTLs (Quantitative trait loci) desarrollados mediante la genética clásica de ligamiento que son en estos momentos la fuente más extensa de información sobre la genómica funcional de estas especies arbóreas.

c) Los nuevos hitos antes mencionados han puesto de manifiesto que el dogma central de la biología molecular descrito en 1970 es más complejo de lo inicialmente descrito (Figura 1). El procesamiento del ARN, la conexión entre el ADN y las proteínas, es el auténtico nudo gordiano (una metáfora griega de un problema insoluble resuelto por un golpe de audacia) de esta expresión génica. La traducción del mRNA transcrito maduro (incluyendo eventos de “splicing”) en la proteína (una entrada principal); junto con la presencia de RNA no codificante y no regulatorio como el rRNA y tRNA (otra entrada principal); y la regulación post-transcripcional y post-trasduccional por parte de pequeños ARN no codificantes pero sí reguladores (miRNA, siRNA, Pirna o snoRNA) (varias entradas de menor importancia, pero críticas) producen el resultado final de la expresión del DNA en un fenotipo concreto (Figura 2).

En estos momentos podríamos pues hablar de una nueva “era” en los estudios sobre la genética de los frutales del género Prunus (albaricoquero, almendro, melocotonero, ciruelo, etc.) y su aplicación en el desarrollo de nuevas variedades dentro de los distintos Programas de Mejora Genética. En este nuevo contexto (postgenómico) se presentan una serie de nuevos desafíos biológicos y oportunidades en la aplicación de toda la gama de las ciencias ómicas (genómica, transcriptómica, proteómica, metabolómica e interactómica) en el desarrollo de estrategias eficaces de selección asistida por marcadores en Prunus. Estas oportunidades son de especial interés en el caso de Prunus, donde es limitado el conocimiento de la asociación entre genes y caracteres agronómicos.

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