Environmentally friendly strategies against Plum pox virus: Effect of PPV infection on the salicylic acid biosynthetic pathway from mandelonitrile in peach

José A. Hernández^a; Pedro Díaz-Vivancos^a,b

^aBiotechnology of Fruit Trees Group, Dept. Plant Breeding, CEBAS-CSIC, Campus Universitario de Espinardo, 25. 30100 Murcia (Spain). ^bDepartment of Plant Biology, Faculty of Biology, University of Murcia, Campus de Espinardo, E-30100 Murcia, Spain.

In a previous work, we reported that the cyanogenic glycosides (CNglcs) pathway can be involved in a new salicylic acid (SA) biosynthetic pathway in peach, with mandelonitrile (MD) linking both pathways (Diaz-Vivancos et al. 2017). In this pathway, MD acts as an intermediary molecule between CNglcs turnover and SA biosynthesis (Diaz-Vivancos et al. 2017). The plant hormone SA plays multiple roles in plants and acts as an endogenous signal mediating plant defense responses against both biotic and abiotic stimuli. In that regards, we study the effect of MD and phenylalanine (Phe), a known SA-precursor, treatments on stress-related plant hormone contents [(SA, abscisic acid (ABA), and jasmonic acid (JA)] and symptomatology in Plum pox virus-infected peach seedlings.

            The PPV-infected peach seedlings were treated with 1 mM MD or Phe for six weeks and then submitted to an artificial rest period again, which was necessary to ensure the later multiplication of the virus. Samples were taken six weeks after the second artificial rest period; the seedlings were inspected for sharka symptoms and were irrigated with either 1 mM MD or Phe during these six weeks. For all the conditions, 12 seedlings were assayed, and another 12 plants were kept as control.

            In PPV-infected seedlings, an increase of about 1.5-fold in total SA content was observed in control and MD- and Phe-treated plants due to the infection (Fig.1), suggesting that the SA biosynthetic pathway from MD is also functional under biotic (Plum pox virus infection) stress conditions, although the contribution of this pathway to the total SA pool does not seem to be important under such condition. We also analyzed the effect of MD and Phe treatments on abcisic (ABA) and jasmonic acids (JA) levels in control and PPV-infected seedlings. The MD treatment produced a drop in ABA levels in control plants. However, PPV-infection induced an increase in ABA content in MD-treated plants, whereas JA levels strongly increased by both MD and Phe treatments (Fig 1).

Figure 1.- Total ABA , JA and SA levels in the leaves of peach seedlings grown in the presence or absence of MD or Phe submitted PPV infection . Data represent the mean ± SE of at least five repetitions of each treatment. Different letters indicate significant differences according to Duncan’s test (P≤0.05).Escribir una leyenda

Regarding PPV symptoms, venal chlorosis and leaf deformation were observed in non-treated seedlings. The mean intensity of PPV symptoms observed in non-treated plants, around 3.0 on a scale of 0 to 5, confirmed the high susceptibility described for this cultivar. Both MD and Phe treatments reduced the severity of symptoms, although Phe in a lesser extent than MD (Fig 2). This response correlated with higher levels of SA and JA in peach leaves, as well as with enhanced ABA levels in MD-treated seedlings.

Fig. 2.- Phenotypic scoring for evaluating sharka symptoms in peach seedlings. Data represent the mean ± SE of at least 10 repetitions. Different letters indicate significant differences according to Duncan’s test (P≤0.05).Escribir una leyenda

As a conclusion, based on our previous results suggesting that the CNgls pathway can be involved in SA biosynthesis via MD, we have found evidences that this new SA biosynthetic pathway also works also under stress conditions. These data suggest that SA biosynthesis from MD could have a positive effect in the response of peach plants to PPV infection, reducing Sharka symptomatology, even though that the contribution of this pathway to the total SA pool does not seem to be relevant.

For more information, please see: Euphresco_success_story_Epi-PPV_2

Project ID: 2015-E-147 Determine different Plum pox virus strains in wild hosts and in stone fruit cultivars with different susceptibility as a part of improved control and surveillance strategies

Virus del rizado amarillo del tomate de Nueva Delhi (Tomato leaf curl New Delhi virus, ToLCNDV): Un nuevo virus que afecta gravemente cucurbitáceas en Almería y Murcia

Miguel Juárez (Universidad Miguel Hernández; Orihuela, Alicante), Blanca Gosalvez y Miguel A. Aranda (CEBAS-CSIC, Murcia)

Recientemente hemos identificado y caracterizado parcialmente un nuevo geminivirus que está causando estragos en los cultivos de calabacín en Almería y Murcia. Se trata de una cepa de Tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV), un primo hermano de nuestro bien conocido virus de la cuchara (Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV). A continuación vamos a resumir brevemente algo de lo que vamos aprendiendo sobre esta cepa de ToLCNDV.

 ToLCNDV en calabacín en España

La primera detección de ToLCNDV en España la hemos hecho sobre plantas de calabacín en cultivos de Campo de Cartagena (Murcia) y de Almería. Los síntomas que hemos identificado en calabacín en campo hasta ahora incluyen: En plantas en producción, cuando suponemos que la infección ha sido tardía, las hojas jóvenes se rizan y se acucharan, normalmente hacia el envés aunque a veces también hacia el haz, y pueden mostrar un amarilleo muy intenso que “sube” hasta las hojas más jóvenes (contrastando con otros virus que causan amarilleo pero que “suben” menos), la planta detiene su crecimiento, y sobre los frutos se puede observar una rizadura suave en la piel del fruto joven que puede acusarse en los más desarrollados (Figura 1). Cuando la infección es temprana, el rizado y acucharado de las hojas jóvenes es tan intenso que se parece al que causa una infestación muy grave de pulgones; las plántulas se arrepollan completamente y no crecen. En este último caso, es prácticamente imposible que la planta pueda llegar a dar frutos.

Figura 1. Síntomas en plantas y frutos de calabacín infectados por ToLCNDV.

Partiendo de plantas de campo con síntomas como los descritos más arriba, preparamos unos extractos de DNA que empleamos para hacer PCRs utilizando cebadores genéricos para amplificar un fragmento del gen de la proteína de la cápsida de geminivirus. Obtuvimos productos de amplificación por PCR en todos los casos, indicando que las muestras estaban infectadas por un geminivirus. Los fragmentos de DNA amplificados fueron secuenciados, y las secuencias que obtuvimos tenían una similitud nucleotídica del 97% con secuencias de un aislado de ToLCNDV de la India que, aparentemente, está causando allí una enfermedad grave en pepino que denominan “yellow leaf crumple” (rizado amarillo de la hoja). La similitud nucleotídica de nuestro aislado de ToLCNDV es menor con otros aislados del virus, todos procedentes y caracterizados en India o en el oriente lejano, pero se sitúa entre el 90% y el 95%. Esta detección ha sido la primera que se ha hecho de ToLCNDV en España.

 ToLCNDV en otras especies vegetales en España

A partir de esta primera detección, hemos recogido, recibido y analizado en nuestros laboratorios numerosas muestras de distintas especies de hortalizas, incluyendo pepino, calabaza, melón, pimiento y tomate, además de calabacín. De momento, ninguna muestra de pimiento o tomate estaba infectada con ToLCNDV. Sin embargo, sí que hemos detectado muestras de pepino, calabaza y melón infectadas por este virus. Los síntomas en estas especies incluyen mosaicos amarillos muy intensos, rizados de las hojas y achaparramiento y pérdida de vigor de las plantas muy acusados (Figura 2).

Figura 2. Síntomas en plantas de pepino y melón infectados por ToLCNDV.

¿Qué se sabe de este virus?

ToLCNDV se describió por primera vez en 1995 como una variante del complejo de virus causante del rizado amarillo de la hoja del tomate afectando cultivos de tomate en India. Posteriormente, el comité internacional de taxonomía de virus lo reconoció como especie viral independiente. Se trata de un virus de la familia Geminiviridae  y del género Begomovirus, en principio geográficamente confinado al subcontinente indio, pero que ha ido expandiéndose hacia otras zonas de Asia, incluyendo China y el oriente medio. Hoy sabemos que también ha llegado a España.

ToLCNDV tiene un genoma de DNA circular de cadena sencilla que consta de dos componentes, el DNA A y el DNA B, cada uno de 2,5 a 2,8 kb de tamaño. Los dos componentes genómicos comparten una región conservada denominada región común o región intergénica, y codifican las proteínas virales. Además de estos dos componentes genómicos, se ha demostrado que al menos algunos aislados de ToLCNDV tienen asociados DNAs satélites de cadena sencilla, circulares, de aproximadamente 1,3 kb, denominados DNAβ o betasatélites. Los betasatélites dependen de los DNAs A y B para su replicación y contienen una secuencia conservada, pero por lo demás son distintos de los DNAs A y B y codifican una única proteína. Es destacable que estos betasatélites tienen propiedades importantes relacionadas con la determinación de la gravedad de síntomas y, quizá, de la gama de huéspedes.

Al principio, la gama de huéspedes de ToLCNDV parecía esencialmente limitada a solanáceas, incluyendo tomate, pimiento (chile), patata y berenjena, en donde causaba la enfermedad que nosotros conocemos como “cuchara”. Más adelante se observó que este virus también causaba una enfermedad responsable de graves pérdidas en cultivos de cucurbitáceas. Así, a la gama de huéspedes inicialmente determinada hubo que añadir pepino, melón, calabaza, Luffa, sandía y calabacín. En una publicación reciente, un grupo de investigación indio ha identificado una diferenciación de cepas según el huésped (solanáceas frente a cucurbitáceas) y también parece identificar una asociación prioritaria de tipos de betasatélites con las especies huéspedes.

ToLCNDV se transmite de forma persistente y circulativa por mosca blanca (Bemisia tabaci Genn.). Esto implica que las moscas pueden permanecer virulíferas desde poco tiempo después de adquirir el virus hasta que mueren. Por otra parte, se ha determinado que algunos virus de la misma familia pueden transmitirse de generación en generación de mosca, aunque este aspecto se desconoce para ToLCNDV. No se ha determinado que se transmita por contacto ni por la semilla.

Existen diversas herramientas para el diagnóstico de este virus. Como la proteína de la cápsida de los begomovirus está muy conservada, los antisueros generados contra otros begomovirus suelen reconocer a este. Así, los antisueros comerciales para detectar el virus de la cuchara, para Squash leaf curl virus (SLCV) y para Watermelon chlorotic stunt virus (WmCSV) funcionan bien en nuestra manos para detectar ToLCNDV, aunque no permiten discriminar entre ToLCNDV y otras especies de begomovirus. Una PCR seguida por el corte del fragmento de DNA por un enzima de restricción específico está dando buenos resultados en nuestros laboratorios (Figura 3).  Muy pronto dispondremos de sondas específicas que nos permitan determinar la presencia de este virus mediante hibridación molecular.

Figura 3. Detección por PCR-RFLP de ToLCNDV en diversos huéspedes. Para cada huésped se usaron tres muestras. Los productos de PCR aparecen sin digerir en el gel de la derecha (a la izquierda en cada bloque) y digeridos con el enzima de restricción SphI (a la derecha en cada bloque). Dos bandas en los productos de digestión indican la identificación específica de ToLCNDV. Como puede verse, las muestras de tomate fueron negativas en este ensayo.

Los medios de control de la enfermedad son, desafortunadamente, muy limitados. El control de la mosca blanca, la eliminación de las plantas afectadas, evitar el solapamiento de cultivos susceptibles, y la mejora de los cerramientos de los invernaderos (en su caso), son las únicas medidas de control disponibles. Se han identificado algunas fuentes de resistencia en tomate y en Luffa, aunque no nos consta que se hayan introgresado en variedades comerciales.

 ¿Qué amenazas representa ToLCNDV en el Sureste español?

La introducción de este virus en España ha sido una muy mala noticia. Desde un punto de vista epidemiológico es de esperar que se comporte como se comportó nuestro conocido virus de la cuchara, con la salvedad de que la gama de huéspedes descrita para este virus es más amplia.  El que potencialmente afecte a cultivos muy diversos puede hacer que exista en el campo una fuente continua de inóculo, con lo cual la dispersión de la enfermedad sólo estará limitada por la presencia o no de mosca blanca. Ojalá la cepa introducida en España sea específica de cucurbitáceas y no se expanda a otros cultivos. En cualquier caso es imprescindible adoptar medidas urgentes para controlar la expansión de ToLCNDV, y seguir estudiando la biología de este virus para poder diseñar estrategias de control adecuadas.

 

 

El virus del mosaico del pepino dulce (Pepino mosaic virus, PepMV), un factor limitante para la producción intensiva de tomate

Raquel N. Sempere, Pedro Gómez, Jorge García-Núñez, Eduardo Méndez-López, Miguel A. Aranda (Grupo de Patología Vegetal del CEBAS-CSIC)

Los virus pueden causar enfermedades muy importantes a las plantas, de la misma manera que las causan a personas y animales. De hecho, los virus son tras los hongos los patógenos de plantas que provocan las mayores pérdidas económicas en plantas cultivadas. El virus del mosaico del pepino dulce (Pepino mosaic virus, PepMV) se ha convertido en uno de los virus más problemáticos en cultivos intensivos de tomate. A continuación se revisan algunos aspectos relacionados con este virus.

PepMV se identificó en 1974 como el agente causante de una enfermedad que afectaba cultivos de pepino dulce (Solanum muricatum) en Perú, y se reconoció como patógeno de tomate en Holanda en 1999. A partir de esta primera cita en tomate, y en un periodo de 4 años, aparecieron focos de la enfermedad causada por PepMV en las principales zonas productoras de tomate de Europa y América. Se piensa que PepMV se introdujo en Europa desde América del Sur dando lugar a múltiples focos epidémicos dispersos geográficamente, incluyendo el Sureste de la Península Ibérica y las Islas Canarias. PepMV hoy en día está considerado como un virus de gran importancia para la agricultura, estando ampliamente distribuido en el mundo (Figura 1).

Figura 1. Distribución de la enfermedad causada por PepMV a nivel mundial

En España, PepMV se describió por primera vez en el año 2000. La mayor incidencia de la enfermedad causada por PepMV se da en las provincias de Murcia, Almería y en el archipiélago canario. De momento, no se ha descrito que PepMV constituya un problema grave en regiones donde se cultiva tomate al aire libre para procesamiento industrial, por ejemplo en Extremadura y La Rioja.

Los síntomas que causa PepMV en tomate comprenden filimorfismos, mosaicos verdes suaves, mosaicos amarillos suaves y brillantes (Figuras 2.1, 2.2 y 2.3), abullonados pronunciados (Figura 2.4) y otras distorsiones de hojas, estriaduras verdes en los tallos (Figura 2.5), crecimiento reducido de las plantas y más recientemente se ha descrito la aparición de necrosis en tallos y frutos.

Figura 2. Síntomas inducidos por PepMV en hoja. 2.1. Abullonados y filimorfismos. 2.2. y 2.3. Mosaicos amarillos. 2.4. Abullonados. 2.5. Necrosis en tallos.

Sin embargo, el mayor impacto de PepMV es en la calidad de los frutos. Los síntomas en frutos pueden aparecer con o sin síntomas en el resto de la planta, y parecen depender de la variedad de tomate, condiciones de luz y temperatura en el interior del invernadero, así como del aislado de PepMV. Los frutos maduros pueden presentar mosaicos o maduración irregular, manifestando un jaspeado en diferentes tonalidades que resulta de una distribución irregular de pigmentos, lo cual hace que pierdan todo o gran parte de su valor comercial (Figura 3). Esta sintomatología del fruto puede desaparecer si las condiciones ambientales cambian, sobre todo teniendo días soleados y cálidos, de forma que parece que la infección se ha erradicado. El hecho de que plantas sintomáticas dejen de serlo no implica que se hayan eliminado los virus, tal y como han mostrado análisis realizados en diferentes casos en los que se observó que la infección en estas plantas continúa.

Figura 3. Síntomas inducidos por PepMV en frutos. Mosaicos y maduración irregular.

La secuenciación de los genomas y la comparación de las secuencias de varios aislados de PepMV procedentes de diferentes países del mundo, ha permitido distinguir cuatro tipos genéticos de PepMV: el tipo “peruano original”, el tipo “europeo”, el tipo “norteamericano” y el tipo “chileno”. En España, hasta el año 2004, la mayoría de las infecciones estaban ocasionadas por aislados de tipo europeo. Una fracción minoritaria estaba compuesta por infecciones mixtas, de las cuales el 80% eran infecciones mixtas europeo-peruano y el 20% europeo-chileno. Sin embargo, a partir del año 2005, la población de PepMV en España dio un giro y comenzaron a prevalecer las infecciones de aislados de tipo chileno. Muestreos realizados en la región de Murcia entre los años 2005 y 2008 revelaron que la población estaba compuesta principalmente por aislados de tipo chileno, aunque en una proporción elevada se daban infecciones mixtas de aislados de tipo europeo y chileno. Por tanto, aunque prevalecen las infecciones de aislados de tipo chileno, los aislados de tipo europeo no han sido desplazados y se mantienen en infecciones mixtas.

El principal problema de la enfermedad causada por PepMV es que existen muy pocos medios para combatirla. Por un lado, el uso de medidas preventivas es muy complicado, porque como se ha dicho más arriba, en determinadas condiciones, el virus puede estar infectando a las plantas sin que éstas manifiesten síntomas. Por otro lado, no existen otras medidas de control, como por ejemplo, el uso de variedades de tomate resistentes, ya que de momento no se han identificado buenas fuentes de resistencia a PepMV. En el grupo de Patología Vegetal del CEBAS-CSIC estamos trabajando en el diseño de “vacunas” eficientes, baratas y fáciles de aplicar que se puedan utilizar para prevenir la aparición de síntomas de la enfermedad en las plantas vacunadas. También estamos trabajando para identificar genes de tomate que confieran resistencia al virus, e introducirlos en variedades comerciales de tomate mediante procedimientos no transgénicos.

 

LECTURAS PARA AMPLIAR ESTA INFORMACIÓN:

Gómez, P., Sempere, R. N., Elena, S. F., Aranda, M. A. (2009). Mixed Infections of Pepino Mosaic Virus Strains Modulate the Evolutionary Dynamics of this Emergent Virus. Journal of Virology 83, 12378-12387.

Gómez, P., Sempere, R. N., Aranda, M. A. (2012). Pepino Mosaic Virus and Tomato Torrado Virus: Two Emerging Viruses Affecting Tomato Crops in the Mediterranean Basin. Advances in Virus Research. L. Gad and L. Hervé, Academic Press. Chapter 14 Volume 84: 505-532.

Sempere, R.N., Gómez, P., Méndez-López, E., Aranda, M.A. (2013). El virus del mosaico del pepino dulce (PepMV): incidencia de las condiciones ambientales, la genética del virus y las variedades de tomate en los síntomas inducidos por PepMV y su acumulación en las plantas infectadas. Agrícola Vergel 364:124-128.